Цена прогресса

В Москве прошла Всероссийская мультимедийная конференция «Генная терапия: настоящее и будущее»

Генная терапия – это модификация или перенос генетического материала в организм больного с целью лечения или профилактики.  Векторы (переносчики) разделяются на вирусные (ДНК- и РНК-вирусы) и невирусные (плазмиды, внеклеточные везикулы, мРНК-трансфекция). В мире зарегистрировано около двух десятков препаратов для генной терапии. В настоящее время проводится несколько тысяч клинических испытаний новых препаратов. Сотни из них были приостановлены из-за неблагоприятных событий, включая единичные случаи смертельных исходов (при введении препаратов на основе аденовируса или аденоассоциированного вируса).

  По словам модератора пленарного заседания академика РАН, президента Ассоциации медицинских генетиков России Сергея Куцева (Медико-генетический научный центр им.  акад. Н.П.Бочкова (МГНЦ), Москва), это уже третья Всероссийская конференция по генной терапии. Она открылась онлайн-докладом академика РАН, директора Института мозга Научного центра неврологии Сергея   Иллариошкина (Москва), посвященным генной терапии в неврологии.  

                                                                               Персонализированная неврология

  Неврологические заболевания характеризуются генетической гетерогенностью. Наибольшие успехи достигнуты в генной терапии спинальной мышечной атрофии (СМА). Аутосомно-рецессивная спинальная мышечная атрофия 5q является самой частой генетической причиной детской смертности (1 случай на 6-10 тыс. рождённых детей, частота носительства – 1 на 40-50 человек). Заболевание характеризуется гибелью спинальных мотонейронов и дегенерацией скелетной мускулатуры. Выделяют пять типов СМА. Если при 0-1 типе двигательные навыки не достигаются, и больные умирают в возрасте до 6 мес. (0 тип) или до двух лет (1 тип), то при 2 типе больной может сидеть и прожить 25 лет, а 3 и 4 типы характеризуются более поздним дебютом (старше 1,5 лет при СМА3 и старше 30 лет при СМА4), возможностью стоять (СМА3) и ходить (СМА4), и не влияют на продолжительность жизни. Суть заместительной генетической терапии СМА 5q заключается в применении антисмысловых олигонуклеотидов и малых молекул, взаимодействующих с пре-мРНК и активирующих корректный сплайсинг 7-го экзона SMN2. Терапевтическая ДНК вводится в клетку с помощью вируса. По данным исследования NURTURE максимальное двигательное улучшение отмечено у младенцев, начавших терапию до появления симптомов СМА.  По словам докладчика, «на наших глазах меняются сложившиеся представления о традиционном делении СМА на различные типы и подтипы с их особенностями прогрессирования и прогноза». При назначении специфического лечения в ранней стадии СМА болезнь может не развиться вовсе, либо манифестировать в более поздние сроки. Например, отмечается трансформация СМА1 в СМА2. Наиболее значимо это сказалось на изменении прогноза   жизни для младенцев с дебютом СМА в течение первого полугодия жизни (СМА1). Помимо СМА, антисмысловые олигонуклеотиды испытываются при болезни Гентингтона (ген НТТ), боковом амиотрофическом склерозе (ген SOD1), болезни Паркинсона (ген LRRK2), прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера (ген MDD).

   На примере редкого генетического заболевания – нейронального цероидного липофусциноза – была рассказана история создания препарата для единственной больной. Речь шла о девочке Миле Маковек (Mila Makovec) c особой мутацией в гене NFSD8. Для поиска метода её лечения был создан специальный фонд. Примерно через полгода возникла идея применить антисмысловой олигонуклеотид.  На синтез молекулы и проведение доклинических испытаний ушло 4 месяца, спустя еще три месяца FDA дало разрешение на интратекальное введение Миласена (так был назван препарат). От идеи до введения препарата этой девочке прошло всего 10 мес. Девочка погибла в 2021 г., но создан важный прецедент, показавший возможность персонализированной генетической терапии.

  Боковой амиотрофический склероз (БАС) – фатальное заболевание с поражением верхнего и нижнего мотонейронов. Моногенные формы БАС обнаруживаются у 10% больных и чаще всего связаны с мутациями гена Cu/Zn супероксид-дисмутазы (SOD1). Имеются данные о ключевой роли ангиогенных пептидных факторов (VEGF и Ang) в выживаемости мотонейронов, особенно в условиях ишемии и  гипоксии.  НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Институт молекулярной генетики РАН и Научный центр неврологии разработали генно-инженерный препарат на основе рекомбинантного аденовирусного вектора, несущего гены VEGF+Ang под контролем промотора цитомегаловируса. Классической моделью БАС являются трансгенные мыши линии B6SJL, экспрессирующие мутацию SOD1-Gly93AIa.  В эксперименте на таких мышах проводилось повторное (с интервалом 2 нед.) введение в икроножные мышцы, мышцы передних конечностей и спины псевдоаденовирусных векторов Ad5-VEGF/Ad5-ANG (200 мкл – 2х10⁸ вирусных частиц), доставляемых в спинной мозг путем антероградного аксонального транспорта. Об этом можно было судить по экспрессии в спинальных мотонейронах маркёрного белка GFP и гена VEGF.   Затем был разработал препарат АдеВаск, который прошел клинические испытания на 100 больных со спинальными и бульбарными формами БАС (препарат вводился внутримышечно в три мышцы с каждой стороны каждые три недели). К сожалению, принадлежащая «Роснано» компания «НТФарма», которая должна была наладить    промышленное производство данного препарата, обанкротилась.

    Генетические формы болезни Паркинсона (БП) составляют 10% случаев. В 2-5% имеется мутация гена GBA.  Разрабатывается таргетная терапия БП с помощью внутривенного введения функциональной копии гена GBA в составе аденоассоциированного вирусного вектора (AAV9-GBA). Для лечения БП также применяются индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), подвергаемые геномному редактированию.  Отредактированные дофаминэргические нейроны трансплантируются в подкорковые ядра. Через несколько лет С. Иллариошкин прогнозирует клиническое применение генной терапии при БП.

                                                                                 Генно-клеточный подход

  Кандидат медицинских наук Мария Воронцова (НМИЦ эндокринологии, Москва) рассказала о генотерапии в детской эндокринологии.  Почти половина населения РФ   ( 65 млн. чедловек) страдает различными эндокринопатиями – ожирением, остеопорозом,  заболеваниями щитовидной железы, сахарным диабетом и т.д. В  докладе был сделан акцент на  генетических  факторах  сахарного диабета 1 типа   (СД 1), врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН), и болезней импринтинга. Для лечения СД1 применяется  CRISPR-таргетированное (см. ниже) редактированное генома мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Речь идёт об активации транскрипции генов, участвующих в развитии поджелудочной железы в сочетании с целенаправленной активацией и поддержанием генов, участвующих в иммуномодуляции МСК.   Популяция бета-клеток в островках поджелудочной железы восстанавливается и начинает вырабатывать инсулин за счет введения выращенных in vitro бета-клеток в сочетании с МСК. 

   Что касается ВДКН, то наиболее часто (более чем в 90% случаев) она обусловлена дефицитом фермента 21-гидроксилазы. Стратегии лечения заключается либо в интеграции копии гена в safe harbor локус, либо в интеграции нормальной копии гена в собственный локус.

   К числу болезней импринтинга относятся синдром Прадера-Вилли, транзиторный неонатальный сахарный диабет (в 40% случаев трансформируется в СД1), синдром Сильвера-Рассела. Методы генной терапии могут быть эффективны, но предстоит решить две проблемы. Во-первых, проблему доставки генетического материала и, во-вторых, попадание в терапевтическое окно.

     Как прокомментировал модератор (С. Куцев), генно-клеточные подходы открывают новые возможности лечения мультифакториальных заболеваний.

                                                                                Редактирование генома

  Генотерапии с использованием геномного редактирования было посвящено выступление кандидата медицинских наук Светланы Смирнихиной (МГНЦ). В основе генотерапии   лежит двуцепочечный разрыв ДНК с последующей репарацией. ДНК разрезают в месте мутации с помощью   белка нуклеазы. Чаще всего при этом применяется метод CRISPR-Cas9 (использование CRISPR- ассоциированного белка 9), открытый в 2012 г. CRISPR – это аббревиатура (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)), переводимая как «группа регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов».  В 2020 г. открыватели метода Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна получили Нобелевскую премию по химии.  При использовании длинных донорских молекул ДНК  в место двуцепочечного разрыва ДНК  можно встроить большой фрагмент (например, несколько экзонов гена   или даже полную кодирующую последовательность  гена)  в выбранную область генома. Таким образом  можно  подобрать лечение, подходящее всем больным с любыми мутацями в конкретном гене. Например, вставить ген CFTR для лечения муковисцидоза. Проще говоря, при точковых  мутациях ставят «заплатки», встраивая в ген исправный участок  ДНК.

   Для моногенных заболеваний с аутосомно-доминантным типом наследования ( с мутациями по типу gain-of-function) можно использовать нокаут мутантного аллеля. При этом экспрессия белка  целенаправленно выключается,  что может приводить к уменьшению симптомов заболевани. Такой подход может быть применен для лечения наследственных кардиомиопватий, связанных с мутациями в гене DES.

   Для лечения миодистрофии Дюшенна  применяется стратегия по пропуску экзонов. Как известно, при этом заболевании появляются делеции и дупликации в гене MDD,  приводящие к сдвигу рамки считывания и, в итоге,  к полному отсутствию белка дистрофина в клетках. Рамку считывания  можно восстановить, удалив из гена ряд экзонов (путем внесения двух двуцепочечных разрывов в ДНК) и получив усеченную, но работающую молекулу дистрофина ,  что приведет к уменьшентю симптомов заболевания.

  По данным базы  СlinicalTrials.gov в настоящее  время проводится 60 клинических испытаний с использованием различных методов редактирования генома.  Почти половина из них приходится на онкологические заболевания.

 Одной  из сложнойстей генной терапии и геномногог редактирования является  доставка генетических конструкций в живой организм.   Существует два разных подхода: in vivo и ex vivo. Подход ex vivo заключается в  редактировании клеток вне организма больного. Для этого  его клетки забирают, редактируют, производят их экспансию, и затем  возвращают больному. Такой  поход возможен лишь для некоторых  заболеваний (бета-талассемия, серповидно-клеточная анемия, ВИЧ-инфекция). Его особенностями  являются, во-первых, полный  контроль за изменениями в геноме, во-вторых, высокая эффективность за счет отбора отредактированных клеток и их экспансии и, в-третьих, трудозатратность.

  При походе in vivo предполагается  редактирование в самом организме больного. С этой  целью  необходимо системное (реже таргетное – в пораженный орган) введение  компонентов геномного редактирования, после чего генетические конструкции попадают в клетки, в которых редактирование происходит. Такой  способ применяется при системных заболеваниях (например, мукополисахаридозе), либо для заболеваний с примущественным поражением одного  органа  (при наличии вирусного вектора с тропизмом к таргетной ткани). При этом  ожидается низкая эффективность редактирования из-за доставки материала не во все таргетные клетки, отсутствует контроль за изменениями в геноме больеого, имеется ограниченный перечень векторов или молекул для доставки, отмечаются побочные эффекты от используемого вирусного векотора и других транспортных молекул.

   Например,  подход in vivo используют при гемофилии B.  При внутривенном введении правильной копии гена F9 вместе с компонентами геномного редактирования ZFN в составе аденоассоциированного вирусного вектора трансген F9 встраивается в локус альбумина собственных гепатоцитов  больного. Этот метод отличается от классической генной терапии, так как происходит интеграция правильной копии гена  F9 в таргетный локус. Обычно при генной терапии происходит либо интеграция в случайный локус ( при использовании ретро- и лентивирусных векторов), либо она вообще не происходит ( при применении  аденовирусного или аденоассоциированного векторов). Без интеграции эффект терапии длится недолго и требует повторных введений препарата.

   Существуют  различные модификации метода CRISPR-Cas9 (праймированное редактирование, редактирование РНК, и т.д.). При повторном введении приходится менять векторы, и возникают  правовые вопросы, т.к.  новый вектор рассматривается как новый препарат. «Когда-нибудь генная терапия  перестанет быть лекарством, и станет технологией», - считает С. Смирнихина.

                                                                                Вектор в скорлупе

   Секционные заседания конференции были посвящены   генной терапии моногенных заболеваний наследственных и многофакторных заболеваний. Также   состоялся симпозиум о новых возможностях  генной терапии на примере  дефицита декарбоксилазы  ароматической L-аминокислоты (AADC). Это редкое заболевание (на Тайване его частота составляет 1:32 тыс. новорожденных) проявляется в первые месяцы жизни гипотонией, двигательными расстройствами (окулогирные кризы), вегетативными нарушениями и задержкой психомоторного развития. Средний возраст   при постановке диагноза – три года.   Средняя продолжительность  жизни без лечения – 9 лет. Диагноз подтверждается  при повышении  уровня 3-О-Метил-Допы (3-ОМД)  с сухом пятне крови (3-ОМД— метаболит дофаминергического пути, который накапливается в случае нарушения биосинтеза нейротрансмиттера (дофамина) из-за дефицита ключевого фермента – AADC). Как отметила  модератор симпозиума   профессор Екатерина Захарова (МГНЦ), это быстрый и информативный тест.   Следующий этап -  проведение  ДНК-диагностики (анализ гена DDC   таргетно или на генетической панели). Для лечения дефицита AADC   применяется эладокаген экзупарвовек. Это рекомбинантый  вектор на основе аденоассоциированного вируса AAV2, содержащий  ген, кодирующий фермент AADC человека (rAAV2-hAADC). Он вводится в  интрацеребрально билатерально (в  скорлупу с обеих строн), минуя   гематоэнцефалический барьер. Доза  вводимого препарата  установлена путем экстраполяции дозы, используемой при лечении болезни Паркинсона. Попав в скорлупу, трансген не интегрируется в геном, а существует внутри ядер нейронов  в виде эписомы. Поскольку нейроны не делятся, ослабление эписомы отсутствует. Оценка экспрессии AADC в скорлупе осуществляется путем ПЭТ-сканирования с F-допой. Клинические испытвания проводились  на 28 детях с дефицитом AADC  на Тайване (препарат вводился трем группам  в разных дозировках, контрольная группа отсутствовала). После лечения отмечалось некоторое улучшение  двигательных и  речевых навыков. Имеются данные о выработке дофамина  через полгода после введения препарата. По данным ПЭТ, повышенное поглощение F-допы  сохраняется через 60  мес. после лечения. 

   Подобные клинические эксперименты ставят тяжелые этические вопросы. Стоимость однократного введения препарата составляет  3 млн. долларов США.  Средняя продолжительность  жизни таких  детей, вероятно, удваивается, достигая 20 лет. Но  насколько  оправданы  подобные траты ради продления существования глубокого  умственно отсталого инвалида? Профессор  Захарова  привела  пример Стивена Хокинга. Но Хокинг страдал БАС  без  когнитивных нарушений, а не дефицитом  ААDC.  Успехи генетики обостряют проблемы этики.

Болеслав Лихтерман, корр. «МГ», доктор медицинских наук, Москва

На снимке:  участники пленарного заседания.