Стволовые клетки: застой преодолен?

После примерно двухлетнего «застопорения», вызванного скорее неадекватной реакцией общественности на упоминание клонирования, исследования в области стволовых клеток самого разного происхождения возобновились с новым и еще большим усердием. Во многом это обусловлено большей теоретической подготовленностью экспериментов, а также более широким охватом как геномных, так и скрининговых подходов к манипулированию этими клетками.

Теория

Не стоит сбрасывать со счетов и тот факт, что лишь в последний год у ученых появилась возможность наконец-то освободиться от проклятого животного «наследия», контаминировавшего клеточные линии человека, что до определенной степени искажало результаты. Дело в том, что в силу технических причин стволовые клетки человека выращивались чаще всего на подложках мышиных клеток-фидеров (от англ. to feed - питать).

Более «чистые» клеточные линии помогают глубже проникнуть в регуляторные механизмы, управляющие размножением и дифференцировкой стволовых клеток, в том числе и эмбриональных, с которыми мало кто особенно хотел возиться в силу непредсказуемости их «поведения».

С другой стороны, за годы вынужденного бездействия сформировалась концепция опухолевых стволовых клеток, с которых начинается рост новообразований. В Центре мозговых опухолей Университета Дьюка в городе Дарем (штат Северная Каролина, США) исследовали механизм, с помощью которого стволовые клетки глиом вызывают радиорезистентность после сеансов ионизирующего излучения (радиотерапия).

В лаборатории центра исследовалась поверхность клеток глиобластомы, взятых в ходе биопсии у нейрохирургических пациентов. Оказалось, что мембрана клеток содержит повышенное количество белка проминина (от prominent - выдающийся, выступающий вперед из ряда), имеющего также сокращенное обозначение Т133, или клеточный детерминант CD, обнаруживаемый также на поверхности Т-лимфоцитов.

Оказалось, что именно уровень Т133 определяет выживание раковых клеток после облучения - в отличие от других клеток опухоли, не имеющих на своей мембране белка Т133. Изучение функции данного протеина показало, что он активирует DDR, или ответ клетки на повреждение ДНК (DNA-Damage Response). Выяснилось, что клетки с Т133 (Т133+) имеют значительно больший туморогенный потенциал, чем без него -Т133-. После облучения количество Т133+ клеток увеличивается с 2-3 до 6-10%.

Известно, что опухоли развиваются на фоне иммунодефицита. Имплантация примерно миллиона раковых клеток в лобную долю мышей с иммунодефицитом, например с SCID (Severe Combined Immunodeficit - тяжелый комбинированный иммунодефицит), приводит к уменьшению тумороген-ной латентности и ускорению роста. Для 76-89% таких клеток характерно образование так называемых нейросфер, чего практически не наблюдается при пересадке Т133- клеток.

На поверхности стволовых раковых клеток помимо Т133 появляются и другие маркеры ракового роста - Musachi и нестин, а также транскрипционного фактора Sox в ядрах. В радиорезистентных клетках уменьшается апоптоз, что вызывается значительно меньшей активацией каспазы-3, одного из главных ферментов апоптоза.

Т133 повышает резистентность и туморогенный потенциал стволовых клеток. Облучение резко повышает уровень фосфорилирования ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) - протеина, открытого у пациентов с атаксией-телангиэк-тазией. Помимо этого в резистентных клетках излишне фосфорилируется Rad - главный регулятор «чекпойнта» (Checkpoint - Chk) повреждений ДНК, а также Chk-протеина. Известно, что белок Rad мобилизует ферменты починки ДНК, а Chk-киназа является основным  сенсором  одно-   и двуцепочечных разрывов ДНК.

При наличии последних Chk вызывает арест, приостанавливая дальнейшее прохождение клеточного цикла, чтобы соответствующие энзимы репаративной системы смогли восстановить поврежденную ДНК. В клетках Т133 после облучения резко возрастает эффективность фосфорилирования ядерных белков гистонов, состояние которых очень важно для восстановления целостности цепей ДНК.

Эксперимент

Справедливость проведенного теоретического анализа подтверждается экспериментальным действием     DBH     (debromo-hymenialdisine), являющегося ингибитором Chk-киназ. Введение DВН перед облучением приводит лишь к небольшому увеличению пролиферации клеток Т133+, тем самым резко снижает радиорезистентность опухолевых клеток глиобластомы.

Сообщается также, что в ходе скрининга большой библиотеки химических веществ было обнаружено вещество, получившее сокращенное название SC (от Stem Cells - стволовые клетки), которое делает эмбриональные стволовые клетки самообновляющимися. Это освобождает их от необходимости получать «питание» от животных клеток-фидеров.

Эксперименты показывают, что стволовые клетки находятся в точке баланса, один путь из которой ведет в сторону подавления пролиферации и дифференцировки, а второй - к сохранению пролиферативного потенциала, то есть самообновлению. Управляются оба процесса ГТФ-азой Ras, мутация гена которой приводит к саркоме у крыс (от rat sarcoma) и раку мочевого пузыря, а также другим опухолям у человека.

В эмбриональные стволовые клетки человека для контроля была введена генетическая конструкция, часть которой кодировала GFP - зеленый флюоресцирующий протеин. Регуляторная часть конструкции включалась только в самообновляющихся стволовых клетках, выключаясь в клетках, вступивших на путь дифференцировки. Самообновление и деление клеток управляется киназным ферментом, активируемым фосфорилированием инозитола, а дифференцировка - ERK, то есть киназой, регулируемой внеклеточными, экстрацеллюлярными сигналами.

Формула SC, подавляющего активность ингибитора Ras, представляет собой цепь из четырех шестиуглеродных циклов - двух азотзамещенных и двух «чистых».
 
Последние два цикла соединены между собой NН-«мостиком». Такой же «мостик» соединяет цепочку с азотзамещенным пятичленным циклом. Опыты по включению и выключению зеленого флюоресцентного свечения показали, что SC является идеальным переключателем при выборе клеточной судьбы. Соединение может действовать на киназу ЕРК, определяя движение клеток по пути дифференцировки, но также и направляя энергию Ras на самообновление эмбриональных стволовых клеток.

Применение относительно простых химических регуляторов упрощает и резко удешевляет - по сравнению с дорогостоящими генетическими методами - проведение столь важных исследований в области изучения стволовых клеток. Но в данном случае ученые приоткрыли то, что уже хорошо известно в природе. Речь идет о тимусе, являющемся главным органом иммунной системы.

В него из костного мозга приходят стволовые клетки, которые проходят «обучение», в результате чего возникает всем известная толерантность. Это свойство иммунных Т-лимфоцитов представляет собой неспособность атаковать в норме клетки собственного организма при сохранении нормального иммунного ответа на внешние и внутренние патогены.

Определяется этот баланс изменением «афинности» Т-клеточных рецепторов (ТСR), то есть их способности связывать те или иные лиганды. Далее сигнал передается в подмембранное пространство цитоплазмы клетки, где сидит упоминавшийся белок Ras, который через каскад МАРК - митогенактивированных протеинкиназ - подталкивает Т-лимфоциты к бурному делению или сохранению «дремотного» состояния.

В первом случае один стволовой лимфоцит может дать 6-8 тыс. потомков-эффекторов, определяющих бурный иммунный ответ, а во втором стволовая клетка остается в выключенном состоянии сохранения пролиферативного потенциала.

Практика

Теория и эксперимент, не выходящие за пределы стен лаборатории, привлекают мало внимания широкой публики, властей и - самое главное - инвесторов! Только успешное опробование результатов научных достижений в клинических испытаниях привлекает финансирование, часть которого идет на те же исследования и разработки (R&D - Research and Development). Все научные журналы сегодня буквально забиты сообщениями об успешных практических испытаниях и применении стволовых клеток в самых разных областях.

«Nature» опубликовал статью Джулио Коссу из Миланского университета «Жизнь и Здоровье», в которой рассказывалось о терапевтическом применении стволовых клеток у собак c миодистрофией Дюшенна (МДД). Это генетическое заболевание возникает в результате мутации в гене дистрофина, приводящей к ранней дегенерации мышечных волокон.

В качестве терапевтических клеток, вводившихся внутриартериально, были взяты мезоангиобласты, представляющие собой стволовые клетки, располагающиеся вдоль сосудов. Результатом явилось восстановление экспрессии генадистрофина, нормальная морфология функциональных мышечных волокон, что подтвердилось миографической регистрацией сокращений одиночных волокон.

Интерес к данной работе заключается в том, что итальянским исследователям удалось выделить стволовые клетки, сохраняющие пролиферативный потенциал во взрослом организме. Мезоангиобласты довольно легко выделить из стенок небольших сосудов, а их число быстро наращивается в культуре тканей. При этом клетки культуры не теряют способности к дифференцировке, то есть образованию мышечных волокон.

После внутриартериального введения такие клетки проходят сквозь сосудистую стенку в мышцы, восстанавливая их волокна с удивительной степенью эффективности. Мезоангиобласты изолировали как у нормальных, так и у дистрофичных собак. В клетки последних вводили «корректирующий» ген микродистрофина, хорошо зарекомендовавшего себя в мышиной модели МДД. Дело в том, что данная «версия» гена легче интегрируется в геном клеток, нежели большой ген обычного дистрофина.

Это еще один важный результат для будущих коррекций генетических дефектов. Он показывает, что модификации возможны далеко не со всеми генетическими вариантами. Чисто «клинически» нормальные и ГМ-мезоангиобласты вводили 5 раз с месячным интервалом. Даже через 5 месяцев после инъекций донорских клеток одна собака нормально ходила, у других степень восстановления была меньше.

Применение аутологических ГМ-клеток более предпочтительно и не требует иммуносупрессии в течение всей жизни. Кстати, для коррекции мезоангиобластов у собак применялась копия человеческого микродистрофина, что, возможно, и обусловило неполное восстановление мышц.

Японец Такахаси Казу со своей стороны показал, что управление плюрипотентностью стволовых клеток возможно, но требует в каждом конкретном случае генетического «перебора» различных комбинаций. В качестве возможных регуляторов определения судьбы клеток были отобраны 24 генапротеиновых факторов. Клетки подобно микробам выращивались на пермиссивных - «разрешающих» - средах.

В качестве агента, лимитирующего их рост, было взято соединение G418. Лекарственный «запрет» можно было преодолеть с помощью промотера Fbx - регуляторного участка одного из генов фибробластов. Ученые исходили из того, что факторы, индуцирующие плюрипотентность, должны были помогать клеткам преодолеть барьер G418 (включить резистентность к нему).

Выросшие на средах с добавлением разных факторов резистентные клетки имеют морфологию и маркеры эмбриональных стволовых клеток. Плюрипотентность исходных фибробластов, имеющих в норме ограниченную способность к дифференцировке, задается комбинацией всего лишь четырех факторов: глиального Оkt, известного онкогена с-Мус, Kruppel-подобного фактора Klf и гена Sох.

Оkt, как известно, определяет глиальную дифференцировку нервных стволовых клеток. Он является продуктом генатранскрипционного фактора POU, включающего образование внутренней клеточной массы бластоцеля (Inner Cell Mass). Именно из этой массы получают эмбриональные стволовые клетки. Оkt кооперируется на промотерах многочисленных генов с белком Sох, регулируя экспрессию генов ростового фактора фибробластов (FGF), упомянутого Fbx и т.д.

Протеин Klf имеет цинковый палец - особую петлю аминокислотной последовательности, которая хорошо укладывается в большую ложбинку двуцепочечной спирали ДНК. Klf известен тем, что подавляет дифференцировку эмбриональных стволовых клеток, поддерживая тем самым их способность к делению. В этом квартете вполне логичным является и ранний ген регуляции клеточного деления лимфоцитов с-Мус, мутации которого приводят к озлокачествлению. Недаром ген Мус был открыт в клетках миелоцитомы, откуда и его название.

Работа японских исследователей показывает, что управлять плюрипотентностью стволовых клеток непросто, но возможно, что доказывается их коллегами из Университета Окаяма. Там с помощью имплантированного устройства удалось осуществить реверсию экспериментальной печеночной недостаточности у мышей. Устройство содержало гепатоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток.

В нью-йоркском госпитале Маунт-Синай гепатоциты получили из тех же клеток мышей, на которые в целях их специализации действовали белком BMP - Bone Morphogen Protein (морфогенный белок костей). А специалисты Института Novocell в калифорнийском Сан-Диего получили клетки эндокринной системы, продуцирующие гормон поджелудочной железы, из эмбриональных стволовых клеток человека.

Все это доказывает, что после определенного периода застоя наука о стволовых клетках вновь на марше, и нас в самое ближайшее время ждут новые удивительные сообщения о ее достижениях.

Игорь ЛАЛАЯНЦ, кандидат биологических наук.
По материалам «Nature», «Nature Biotechnology».