Опираясь на новую физиологию сердца. На пути создания препаратов, предотвращающих возникновение патологических состояний в результате перегрузок, невесомости и ударной волны

Год назад в Российском национальном исследовательском медицинском университете им. Н.И.Пирогова была образована новая структурная единица – Институт физиологии. С его директором, профессором Андреем КАМКИНЫМ встретился обозреватель «МГ» Альберт Хисамов и попросил рассказать о главных направлениях работы учреждения, значимых открытиях.

Первые открытия

– Андрей Глебович, одним из главных научных направлений работы возглавляемой вами кафедры физиологии, а затем Института физиологии стало изучение механоэлектричес­кой обратной связи в сердце и её механизмов на клеточном уровне. Как возникли истоки этих исследований?

– В 1978-­1979 гг., будучи студентом 5-­го и 6-­го курса отделения биофизики медико-­биологического факультета 2-­го МОЛГМИ
им. Н.И.Пирогова, я приступил в рамках дипломной работы к выполнению экспериментов по изучению межклеточного взаимодействия пар нейронов. Мне быстро надоело вводить, как это было принято, в каждую из двух клеток по 2 микроэлектрода – 1 стимулирующий и 1 регистрирующий изменения потенциалов. В этом случае редко какие эксперименты удавались. Тогда мне пришла идея использовать для раздражения клетки и отведения потенциалов один микроэлектрод. Это было возможно только при фиксации тока во всей измерительной схеме, включая клетку, а для этого надо было в измерительную цепь включить резистор, обладающий сопротивлением порядка 5 гигаом, а входное сопротивление усилителя должно быть минимум на 3 порядка больше. Теоретически всё было правильно, а вот практически… При таких высоких величинах сопротивлений в цепи измерений ток мог течь и по изоляции проводов, сопротивление которой было существенно ниже, то есть внешний слой становился проводником, и измерительная схема не работала. Однако мне удалось решить этот вопрос чисто технологически, подобрав и заказав специальные материалы для изоляции радиоэлектронных элементов и проводов.

В результате я создал схему, которая позднее получила название Current Clamp. Теперь фиксация тока в цепи измерений и позволяла с высокой степенью точности стимулировать и отводить потенциалы при помощи только 1­го микроэлектрода, что ранее было невозможно. Я выполнил макет прибора, который от 2-­го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова экспонировался на ВДНХ СССР и завоевал лидирующую позицию, а затем был отправлен на выставку в Чехословакию. Слухи о его создании каким­то образом дошли до Государственного комитета Совета Министров СССР по науке и технике. Оттуда приехал человек, попросил у меня техническую документацию и полученные к тому времени патенты. Под нашим контролем было запущено производство на одном из оборонных предприятий. Таким образом, был создан измерительный прибор мирового уровня, который успешно продавали в ведущие зарубежные научные центры. Через много лет я обнаружил его активно работающим в лабораториях Берлина, Лондона и Оксфорда…

После этой истории обо мне услышали, как о молодом профессиональном электрофизиологе и пригласили на закрытое совещание, где среди присутствовавших находился вице­-президент Академии наук СССР, академик Юрий Овчинников. Рассматривались вопросы защиты населения и наших военных от всевозможных поражений ударной волной и в том числе защиты лётчиков от действия гипергравитации (перегрузок) при маневрировании. В этой связи обсуждалась целесообразность дальнейшего исследования влияния модных в те времена нейропептидов как неспецифических регуляторов различных функций организма и их потенциальное применение для предотвращения действия на организм физических факторов. Я высказался, что не совсем правильно искать неспецифические регуляторы, а необходимо поп­робовать найти специфические клетки или их структуры, реагирующие на механическое действие, в чём бы оно ни выражалось. Все с недоумением переглянулись, но после обсуждения было принято решение, что данное суждение не лишено логики. Мне, тогда уже аспиранту, предложили начать работу в этом направлении вместе с заведующей курсом физиологии медико­биологического факультета профессором Ириной Киселёвой под общим контролем академика Ю.Овчинникова.

Для работы мы выбрали сердце, в котором присутствуют процессы и сокращения и растяжения клеток, и уже через 2 года,
в 1983 г., нашли специфические клетки, работающие как механо­электрические преобразователи в миокарде – фибробласты сердца. Также мы выяснили, что кардиомиоциты эффективно реагируют на растяжение ткани, и такая реакция приводит к возникновению экстрасистол. На основании экспериментальных данных предположили, что существуют ионные каналы, реагирующие на механическое воздействие.

В те времена эта точка зрения считалась даже не спорной, а парадоксальной. Наши ведущие физиологи отнеслись к ней весьма скептически, посчитав, что мы занимаемся чем­то несуразным.

– Тем не менее после этого вас направили в длительную зарубежную командировку…

– После прохождения стажировки в Институте биологической физики АН СССР в Пущино я поехал в Университет Гиссена в ФРГ. В ходе одной из конференций познакомился с руководителем лаборатории Лондонского университета Максом Лабом, который ещё в 1963 г. предположил наличие в сердце механоэлектрической обратной связи. Он наблюдал за фазами сокращения и расслабления миокарда, и это механическое напряжение воздействовало на электрическую систему сердца, формирование потенциала действия и потенциала покоя. Эту идею сразу посчитали сомнительной, и на учёного свалилась масса неприятностей. Но он не отступал.

Макс родился в Южной Африке, в Йоханнесбурге и переехал в Лондон в 1968 г., став стипендиа­том Британского совета (British Council). На момент нашего знакомства ему было 47 лет, но почти 20­летняя разница в возрасте не помешала нам стать друзьями.

На протяжении многих лет Макс использовал в своих исследованиях старую рутинную методику, при которой применялись электроды с присосками, а сердце изнутри раздувалось баллончиками. Несмотря на сомнительные данные, его статьи публиковали. Я предложил ему тогда перейти на микроэлектродную схему исследований, но он был слишком консервативен и продолжал проводить опыты по технологиям 1960­-х гг. Впрочем, именно тогда мы с Максом окончательно поняли, что наши действия не лишены смысла.

Примерно в это время, в 1984 г., американский профессор Фредерик Сакс из Университета Буффало обнаружил в культуре ткани скелетной мышцы эмбриона цыплёнка ионные каналы, которые он идентифицировал как механоуправляемые. К его работе также поначалу отнеслись скептически. Однако позднее стало очевидным, что все клетки организмов имеют механоуправляемые каналы. Я продолжал эксперименты, и к 1990 гг. стало ясно, что мы вышли на механизм механоэлектрической обратной связи.

После этого сформировалось международное творческое партнёрство: к нам с Ф.Саксом и профессором М.Лабом, возглавившим кафедру фундаментальных наук Лондонского университета, присоединился Эрик Оноре из Французского института здравоохранения и медицинских исследований, чуть позже – окончивший МГУ Сергей Сухарев из Мэрилендского университета и австралиец Борис Мартинак из Кардиологического научно-­исследовательского института Виктора Чанга в Новом Южном Уэльсе. Договорились о разделе «сфер влияния». Мы с коллегами стали заниматься потенциалами и суммарными токами механо­управляемых каналов, Фред – изучением канальной активности непосредственно на одиночных каналах, Сергей и Борис – молекулярной организацией каналов, а Эрик исследовал одну из групп ионных каналов и впервые показал, что именно она относится к механоуправляемым и, главное, они формируют потенциал покоя клеток. Так был решён парадокс Ходжкина­Хаксли­Каца, над разгадкой которого учёные бились в течение 50 лет…

Кардиомиоциты и фибробласты

– Чем завершились ваши поиски в этом направлении?

– Сначала мы показали, что фибробласты сердца принимают участие в его работе не только в качестве структурного скелета, как некоторые полагают до сих пор, но и, являясь механоэлектричес­кими преобразователями, представляют собой важный фактор внутрисердечного регуляторного механизма. В ходе экспериментов выяснилось, что в мембранах клеток находятся специфические структуры, чувствующие механическое раздражение как полноценный для себя физиологический сигнал – механоуправляемые ионные каналы. Они имеются и у фибробластов, и у кардиомиоцитов.

Как известно, в проводах электрический ток представляет собой направленное движение свободных электронов, а в электролитах, которыми является внешняя и внутренняя среды клеток, носителем электрического тока являются ионы, движение которых осуществляется через ионные каналы. Величина тока через один канал ограничена величиной потока ионов. Именно изучением токов через механоуправляемые каналы мы начали заниматься с середины 1990­-х гг. используя самую современную на том этапе технологию Patch Clamp или фиксацию потенциала в цепи измерений. Токи через механоуправляемые каналы у кардиомиоцитов и фибробластов на фоне растяжения этих клеток были нами подробно изучены. Кстати, эффективную технологию растяжения клеток придумали именно мы, и это привело к другим открытиям.

Оказалось, что при гипертрофии миокарда в клетках возникает интенсивная экспрессия белков механоуправляемых каналов. Увеличение их количества приводит к тому, что при растяжении клетки суммарный электрический ток через механоуправляемые каналы резко возрастает по сравнению с клетками от здоровых сердец. Если мы растягиваем кардиомиоциты гипертрофированного сердца только на 2 микрона, через механоуправляемые каналы этих клеток возникает ток, примерно в 10 раз превышающий ток, регистрируемый в клетках от здорового сердца. Это вызывает изменение потенциала покоя и потенциалов действия, что и приводит к патологическим ритмам сердца при небольших изменениях внутрикамерного давления.

Кардиомиоциты нельзя впрямую отнести к механоэлектричес­ким преобразователям. Они сами генерируют потенциалы действия, обладают собственной функцией, но оказалось, что при растяжении миокарда или отдельных клеток кардиомиоциты деполяризуются. В результате возникают изменения в форме потенциалов действия, которые приводят к экстрапотенциалам действия, а затем – к варианту развития пароксизмальной тахикардии, хотя к клеточному уровню это не очень применительно. Кардиомиоцит «бьётся» в экстрасистолии, что кончается фибрилляцией сердца. Таким образом, можно объяснить некоторое количество смертей у пациентов после инфаркта миокарда, когда они после лечения резко поднимаются с кровати, что меняет, даже незначительно, внутрикамерное давление.

Но почему в клиниках не наб­людается большое количество летальных исходов? Оказалось, этому противодействует высокая гиперполяризация фибробластов. Эти клетки генерируют механоиндуцированный потенциал, возникающий в ритмах сокращений. Итак, кардиомиоциты деполяризуются, а фибробласты – гиперполяризуются, а за счёт находящихся между ними белковых структур, называемых коннексонами, происходит выравнивание потенциала. И сердце продолжает работать в исходном режиме. Это было показано нами к 1998 г.

В 2000-­х гг. мы предложили новую схему работы сердца, новые принципы его регуляции. Она коренным образом изменила наши представления о работе сердца, была воспринята позитивно научным сообществом и вошла в учебники физиологии и кардиологии во всём мире.

Далее, занимаясь вопросами регуляции механоуправляемых каналов, мы пришли к вопросам изучения влияния перегрузок, невесомости и ударной волны низкой интенсивности на организм человека на клеточном и молекулярном уровнях.

– То есть вы снова вернулись к проблеме, поставленной на государственном уровне в начале 1980-­х годов?

– Совершенно верно. Сегодня эта тема актуальна как никогда. Идут боевые действия, и необходимо понять, как, например, воздействует в течение длительного времени ударная волна низкой или слабой интенсивности на артиллеристов, миномётчиков, танкистов, сапёров, взрывников в рудодобывающей отрасли. Пос­тавлена задача выяснить, как в таких условиях меняются параметры механоуправляемых каналов.

Три года назад мы подали заявку в Российскую академию наук на выполнение обширной программы по этой проблеме. Она успешно прошла несколько комиссий, но пока мы проводим исследования за счёт внутренних резервов.

Что удалось сделать? Мы рассчитали и смоделировали создание гипергравитации (перегрузок), для чего под руководством нашего доцента Вадима Митрохина создали центрифугу для мелких лабораторных животных, которую одно из оборонных предприятий воплотило в металле. Оказалось, что параллельно с нами эти работы проводились в Южной Корее, где подобная центрифуга появилась на полгода раньше нашей. Мы были вторыми в этом заочном соревновании. С помощью центрифуги стало понятно, что происходит с механоуправляемыми каналами клеток крыс при гипергравитации.

Оказалось, что при кратковременных перегрузках 4g в течение 7 дней происходит существенное увеличение количества транскриптов генов механоуправляемых каналов. Это приводит к увеличению синтеза белков каналов с последующим увеличением суммарного тока через механоуправляемые каналы (просто за счёт увеличения их количества). Пилоты летают не 7 дней, а долгие годы, и у части из них возникают проблемы с работой сердца. Наша задача – устранить чрезмерные токи через механоуправляемые каналы, возникающие при растяжении кардиомиоцитов.

И наоборот, количество транскриптов генов механоуправляемых каналов падает всего лишь через 7 дней моделируемой невесомости (микрогравитации). Это приводит к уменьшению синтеза белков ионных каналов. Каналов становится мало, и мы регистрируем уменьшение суммарного тока, проходящего через них. Токи не возникают, если в этом случае растягивать кардиомиоциты. Значит, в клетку не поступают в должном объёме ионы. Она пытается защитить себя уменьшением своего объёма, происходит её атрофия. И теперь мы понимаем, почему космонавтов – после длительного нахождения в состоянии невесомости – выносят на руках из спускаемых аппаратов и отправляют на длительную реабилитацию.

Кстати, аналогичные микрогравитации процессы происходят у больных, длительное время прикованных к кровати.

Мы находимся сейчас на пути создания линейки фармацевтических соединений, активирующих работу механоуправляемых каналов – для деятельности в невесомости или ингибирующих работу этих каналов при длительной гипергравитации.

Что касается исследований с ударной волной низкой интенсивности, то на сегодняшний день у нас есть предварительные эксперименты, связанные с изменением давления, приложенного к мембране кардиомиоцитов. Исследование одиночных каналов показало, что они очень быстро активируются.

С учётом предварительных данных мы сочли целесообразным разработать прибор, который по определённой компьютерной программе моделирует взрывную волну низкой интенсивности разной силы, в различных временных участках и временной последовательности. Этот прибор мы условно назвали «Пушка», и сейчас одно из предприятий военно­промышленного комплекса будет воплощать его в металле. Он создаёт не модель, а реальную ударную волну. Разница между моделью и ударной волной заключается в крутизне так называемого переднего фронта. У реальной волны крутизна переднего фронта практически перпендикулярна, а у модели имеет сильный наклон. Мы смогли решить этот вопрос, благодаря тому, что применили клапаны, которые открываются в течение 2 миллисекунд и так же быстро закрываются, осуществляя подачу воздуха под определённым давлением к крысам. При такой скорости работы воздушных клапанов создаётся перпендикулярный фронт давления ударной волны – как от боеприпаса.

За рубежом ударную волну в эксперименте создают следующим образом: в накопитель закачивают воздух, а внешнюю трубку закрывают резиновой заглушкой. Воздух из накопителя вырывается при разрыве резинки. Это очень приблизительная модель ударной волны, предназначенная только для одного эксперимента и не обеспечивающая серии «взрывов» в течение длительного времени. Наша «Пушка» получилась достаточно дорогой, но если проект профинансируют, то уже к осени этого года изобретение будет полностью готово.

На сегодняшний день у нас есть все методы оценки таких состояний, возникающих при гипергравитации, микрогравитации и ударной волне низкой интенсивности. В частности, это генетические методы оценки количества транскриптов каналов, методы оценки количества синтезируемого канального белка для одиночных каналов, электрофизиологические методы регистрации потенциалов и методы оценки суммарной активности механоуправляемых каналов. Мы можем также регистрировать ток, текущий через одиночный канал на фоне растяжения клетки.

Прототип найден

– На протяжении ряда лет вы работали одним из главных редакторов международного концерна Springer и шеф­редактором ежегодной книжной серии Mechanosensitivity, стали автором одного из самых известных учебников по физиологии. Как вы можете оценить состояние мировых разработок в области механоэлектрической обратной связи и место на этом поприще возглавляемого вами института?

– В научном мире принято обсуждать только опубликованные разработки. По моим данным, десятки лабораторий крупнейших зарубежных медицинских центров занимаются проблемой механоэлектрической обратной связи, в основе которой лежат механоуправляемые каналы клеток. На сегодняшний день достаточно изучены молекулярная организация для большинства каналов, их проводимость, ряд других параметров.

Что касается нашего места в мировых разработках этого направления, то хочется отметить, что доказательство механоэлектрической обратной связи, её клеточные, канальные и молекулярные механизмы принадлежит нам и детально опубликовано в мировых изданиях ещё в 1998-­2003 гг. Именно после наших работ начался мировой «бум» в этом направлении как самом перспективном на том этапе. О дне сегодняшнем достаточно сказать, что работы Института физиологии РНИМУ им. Н.И.Пирогова по гипергравитации и микрогравитации выложили на сайт американского Национального управления по аэронавтике и исследованию космического пространства (NASA). Замечу, что наши исследования не финансировались этой влиятельной организацией. Впрочем, они также не финансировались сходной и не менее влиятельной организацией в нашей стране.

Мы стали первыми, кому пришла идея связать действие гравитации на организм человека непосредственно со всем пулом механоуправляемых каналов, реагирующих не только на гравитацию. В этих исследованиях мы заметно ушли вперёд на мировом уровне, а при должном финансировании продвинемся ещё дальше. Это как раз именно то необходимое опережающее научно­техническое развитие, которое обеспечит конкурентоспособность страны и о котором сегодня все говорят.

В последние десятилетия заметно шагнула вперёд аритмологическая хирургия. Сейчас специалисты высочайшего уровня находят в сердце мельчайшие очаги на уровне 1-­2­-3 клеток и с помощью лазерного или иного воздействия уничтожают их, устраняя патологическую активность. В нашем случае речь идёт о процессах, затрагивающих одновременно все кардиомиоциты и фибробласты сердца, и от которых невозможно избавиться хирургически.

В далёкой перспективе регулировать эти процессы можно с помощью генной инженерии, снизив или увеличив экспрессию генов определённых каналов. В близкой перспективе – создать лекарственные препараты, которые устраняют негативные электрофизиологические проявления в сердце за счёт селективного блокирования или, наоборот, активации механоуправляемых каналов.

Мы изучили работу этих каналов, их регуляцию и нашли мишень, на которую могут действовать те или иные соединения. Таким образом, можно выходить на создание прототипа веществ, которые при перегрузках будут блокировать повышенную активность каналов, предотвращая возникновение аритмии, или активировать сниженную активность каналов при невесомости.

Многие учёные во всём мире потратили десятилетия на поиски таких соединений, а повезло нам. Мы нашли прототип будущего препарата – оксид азота.

Регуляция каналов идёт в двух направлениях. Первое – через специфический фермент, который активирует в клетке работу вторичных мессенджеров (посредников), это фермент – растворимая гуанилатциклаза. Через неё оксид азота (NO) активирует внутриклеточные пути, а продукты этих путей регулируют механо­управляемые каналы. Второе – мы показали, что оксид азота может напрямую регулировать работу механоуправляемых каналов за счёт нитрозилирования белков канала. Это открывает большие перспективы в подавлении или активации механоуправляемых каналов.

Думаю, что в недалёком будущем мы совместно с фармхимиками сможем синтезировать препараты, которые, в частности, будут предотвращать отстранение лётчиков от полётов в связи с заболеваниями сердечно­сосудистой системы, и при применении которых вернувшиеся на Землю космонавты не будут испытывать последствий невесомости.