Антибактериальный репортёр

Старшему преподавателю Центра молекулярной и клеточной биологии Сколтеха, кандидату химических наук Дмитрию ЛУКЬЯНОВУ 32 года. Он является автором 48 публикаций в престижных международных журналах. Возглавляемая им научная группа занимается поиском новых соединений с антибиотической активностью в природе и химических библиотеках и исследованием механизмов их действия в клетках бактерий. Обозреватель «МГ» Болеслав ЛИХТЕРМАН попросил молодого учёного рассказать об этой работе.

Биография и образование

– Дмитрий Александрович, расскажите немного о себе.

– Я родился в Омске, где родители учились в медицинском университете. Затем мы переехали в Курган, где я пошёл в школу. Последние два года (10-11 классы) учился в СУНЦе (специализированном учебно-научном центре) при Новосибирском государственном университете. Дальше, соответственно, я поступил на химфак МГУ, а после этого в Сколтехе окончил четырёхлетнюю аспирантуру и защитил диссертацию. Сейчас основное моё место работы здесь, а ещё я старший научный сотрудник в МГУ на химическом факультете, где читаю часть курса по молекулярной биологии студентам.

– Как соотносится исследовательская деятельность с преподавательской? Сколько часов в неделю вы преподаёте?

– У меня есть курс в Сколтехе, который читается весной в течение 8 недель по 6 часов в неделю. А ещё я помогаю организовывать практикум, который ведёт профессор Центра молекулярной и клеточной биологии Ольга Донцова, это 8 недель по 9 часов в неделю. В МГУ у меня научная ставка, там не так много преподавания – три недели по три часа. Получается, что у меня осенью на химфаке преподавание, а потом зимой и весной – в Сколтехе.

О выборе научного направления

– На сайте Сколтеха написано, что вы руководите группой по изучению антибиотиков. Что это за группа, сколько там человек?

– Начну немножко издалека, с того, как вообще я выбрал своё направление. Мне всегда было интересно заниматься биохимией, молекулярной биологией, в том числе сопряжённой с медициной, но вот стать врачом, честно говоря, я никогда, наверное, не хотел, глядя на родителей. Папа у меня стоматолог-хирург, мама гинеколог. После операции они постоянно переживают за больных. И глядя на это, я подумал, что я немножко от этого дистанцируюсь, но вот недалеко ушёл.

– Так почему всё-таки антибиотики?

– Мне была интересна, во-первых, молекулярная биология, то есть разбираться в механизмах клеточных, как что работает. Во-вторых, антибиотики всё-таки близки к медицине, и эта тема мне тоже небезразлична. И, наверное, самое важное, что мне интересно именно разбираться в механизмах, как это работает, как антибиотики могут нарушить тот или иной процесс, как бактерии могут от этого спастись и как нам им помешать.

– Знаю, что вы блестяще защитились, видел ваш автореферат и отзывы научных руководителей. Почему их было двое?

– Во-первых, потому что две специальности – молекулярная биология и биорганическая химия. Во-вторых, я в лабораторию, которая в МГУ находится, пришёл в 2015 г. студентом третьего курса, и, соответственно, с того времени моей работой руководил Илья Остерман. Он, собственно, меня как раз и познакомил со всей работой, начиная с микробиологической части и заканчивая разными молекулярно-биологическими методами. Мой второй руководитель – это член-корреспондент РАН Пётр Сергиев. Он же был руководителем в аспирантуре, и все время присутствовала концепция: микрошеф и макрошеф. То есть с Ильёй Андреевичем мы обсуждали какие-то текущие дела, эксперименты и так далее, а Пётр Владимирович больше задавал вектор движения, скажем так, всей этой деятельности.

По сути, группа, которая у нас сейчас есть, это продолжение того, что было начато в МГУ. Изначально она основана Петром Владимировичем, Ильёй Андреевичем в лаборатории Ольги Анатольевны. Здесь такая сложная структура потом получилась, потому что И.Остерман переехал в Израиль и покинул проект, и я пришёл на его место. Конечно, мы с ним продолжаем сотрудничать. На данный момент у нас есть трое научных сотрудников, а также несколько студентов и аспирантов МГУ и Сколтеха.

Методы исследования

– Что вы изучаете?

– Основная наша работа – это поиск различных антибиотиков, в первую очередь в природных образцах. У нас есть двое сотрудников, которые работают с продуцентами, то есть им приносят образцы почвы, воды, разные другие субстраты, и дальше они из них выделяют, соответственно, уже чистые культуры и проверяют, способны ли они продуцировать антибиотики. Здесь у нас главный человек – кандидат биологических наук Юлия Закалюкина, в Сколтехе она старший научный сотрудник, а на факультете почвоведения МГУ – научный сотрудник.

Единичные колонии, которые показали активность, мы наращиваем в объёме 50-100 мл и пытаемся разобраться, что именно за соединение продуцирует тот или иной организм. У нас очень важное отличие от большинства лабораторий. Много кто пользуется подходом, который ещё Ваксман предложил, – делать газон штамма, который мы хотим, грубо говоря, убить, и дальше на него наносить различные соединения, которые было бы интересно проверить. Мы берём чашку Петри с агоризованной средой. Дальше на неё наносим тест-штамм, содержащий репортёрную конструкцию, а затем – культуральную жидкость каких-то микроорганизмов, полученных в результате культивации, или химические соединения. Потом ставим этот штамм инкубироваться в термостат, и на следующий день смотрим, есть ли какая-то активность. В случае появления зоны ингибирования у нас имеется соединение с антибиотической активностью.

В нашей лаборатории Пётр Владимирович и Илья Андреевич разработали такую репортёрную систему, которая позволяет не только посмотреть на зону ингибирования, а также ещё и предположить механизм действия соединения. До того, как мы узнали, что это за формула, известно про соединение что-то или нет, мы можем с самого первого дня предполагать, каков механизм его действия.

– На основании чего?

– На основании того, что разработанная ими репортёрная конструкция содержит в себе два флуоресцентных белка, стоящих под специальными промоторами. Мы добавляем образец, который хотим протестировать к газону клеток E. Coli, содержащих плазмиду с этой репортёрной конструкцией. И если у нас соединение ингибирует биосинтез белка, то срабатывает один промотор и синтезируется дальний красный флуоресцентный белок, который называется Katushka2S.

В случае же, когда мы добавили соединение, которое повреждает ДНК, то запускается другой промотер и синтезируется другой белок – RFP, и вот мы можем таким образом это детектировать.

– Что такое репортёрная конструкция?

– Это конструкция, позволяющая идентифицировать механизм действия антибиотика. Например, у нас есть два антибиотика: эритромицин и цифрофлоксацин. Видно, что при применении цифрофлоксацина против репортёрного штамма на чашке Петри появляется зелёное гало, то есть повреждена ДНК и в ответ на это синтезируется флуоресцентный белок RFP. При применении эритромицина видно красное гало – синтезируется белок Katushka2S.

Практическое значение исследований

– Это фундаментальная наука. Какое прикладное значение она имеет?

– Наша работа напрямую прикладного значения не имеет, то есть мы не доводим какой-то антибиотик до того, чтобы он превратился в таблетку на прилавке. У нас другая задача: при помощи репортёрной системы мы сначала можем предположить механизм действия соединения, у нас есть сотрудники, которые занимаются хроматографией, разделением этих образцов. Далее с помощью высокоточной масс-спектрометрии мы в большинстве случаев предполагаем, что за соединение имеет активность. А затем как раз начинается самая интересная для нас часть. С большим количеством соединений, к сожалению, мы приходим к тому, что они уже известны, как какой-нибудь условный эритромицин. Но бывают случаи, и, к счастью, не так редко, как могло бы быть, когда у нас попадаются какие-то соединения, для которых механизм действия не до конца описан. И вот как раз здесь мы включаемся активно в работу. Разбираемся, как именно с точки зрения биохимии антибиотик действует на бактерию.

Поиск антибиотиков в экзотических локациях

– Пишут, что вы занимаетесь поиском антибиотиков в каких-то экзотических локациях: в озёрах Тибета, Антарктиде, пасти медведя, носу свиньи и т.д.

– У нас есть замечательные коллабораторы из Китая, в частности, профессор Чанган Сан, с которым искали антибиотики в солёных озёрах Тибета. И мы их нашли, пусть, может быть, уже известные соединения, но зато в таких потаённых местах.

Вторая часть работы, которую вы называли – про пасть медведя и назальную микробиоту свиньи. У нас есть коллабораторы из Института биоорганической химии, которые ездили в экспедицию, находили животных или просили прислать им мазки из пасти или носа. И дальше мы совместно разбирались, что за антибиотики там продуцируются, как они работают. В частности, из пасти медведя был выделен амикумацин А, который в целом уже известен. Но мы с коллегами разобрались, как именно он работает.

Параллельно у нас есть коллеги, которые ездят в экспедиции, привозят образцы из Антарктиды и Северного Ледовитого океана. Другие – смотрят почву, ассоциированную с растениями: есть ли там какие-то бактерии, которые могут участвовать в защите растений. Может быть, они продуцируют антибиотики? У нас сейчас есть несколько продуцентов, полученные из почвы рядом с растениями.

– В вашей кандидатской упоминается антибиотик ауропланин. Какие-то связанные с ним надежды оправдались?

– Продолжаем работать. О том, чтобы его вывести на рынок, речи пока не идёт. Есть ещё несколько аспектов в его механизме действия. С ними нам хотелось бы разобраться.

Сравнение российских и зарубежных антибиотиков

– Насколько сравнимы по эффективности российские и зарубежные антибиотики?

– Я бы больше, наверное, фокусировался не на том, где они произведены, а смотрел на каждую конкретную ситуацию по отдельности. Потому что у антибиотиков есть разные поколения. То есть, возможно, что к отечественным у человека уже появились устойчивые бактерии, а к зарубежным, нового поколения, – ещё нет.

– Но вы же её изучаете?

– Да, это у нас один из инструментов для того, чтобы понять, как именно антибиотик работает.

Проблема антибиотикорезистентности

– Насколько проблема антибиотикорезистентности сейчас решаема? Ведь очень мало новых антибиотиков появляется.

– Наша работа в том числе направлена на то, чтобы понять, как антибиотик связывается со своей мишенью, какие группы важны, какие не важны, какие можно модифицировать, какие нельзя. И в эту сторону мы тоже двигаемся, пока у нас это всё в разработке, но направление довольно интересное.

На мой взгляд, нужно не только искать новые антибиотики, потому что какой бы замечательный тип мы не нашли, всё равно так или иначе бактерии смогут его обойти и развить к нему устойчивость. Тут скорее важно грамотно применять, что уже есть, начиная с того, что не продавать их кому попало без рецепта в аптеках. К сожалению, некоторые люди даже при каких-то незначительных симптомах простуды тут же начинают есть разные амоксициклины (бета-лактамы), суммамеды (макролиды) и другие соединения с антибиотической активностью, даже превентивно.

А если говорить про какие-то тяжёлые случаи, то, насколько я себе представляю медицинскую отрасль, есть антибиотики, которые не выходят на рынок. Их припасли на «чёрный день». Существует и другой путь. Он тоже может быть в целом реализуем, – это фаготерапия.

Классификация антибиотиков

– Есть ли у вас какая-то классификация антибиотиков?

– В зависимости от цели есть разные способы их классификации. Первый вариант – по химической структуре. Другой – по механизму действия, на какой именно этап жизни бактерий они могут влиять. Тут нам наиболее интересны ингибиторы биосинтеза белка, поскольку изначально наша лаборатория в МГУ занималась именно этим, то есть у неё основной фокус был на нуклеопротеиды – соединения, которые имеют в своём составе как нуклеиновые кислоты, так и белки. И вот таких структур в клетке основных две: теломераза, про которую мы говорить сегодня не будем, и рибосома – отвечает за биосинтез белка. Мы изучаем соединения, которые могут влиять на разные этапы этого процесса.

Уникальность лаборатории

– В чём уникальность вашей лаборатории?

– В мире, в том числе в России, много лабораторий, которые изучают антибиотики. Мы занимаемся не только поиском их продуцентов и разбором того, какие именно соединения они вырабатывают, но и исследованием механизмов действия. То есть у нас проходит практически полный цикл этих работ, начиная от того, что вот имеется какой-то штамм-продуцент, условный стрептомицет. Дальше мы можем его вырастить в жидкой среде, выделить хроматографически и идентифицировать с помощью масс-спектрометрии, что за соединение даёт антибиотическую активность. И после этого разбираемся с соединением, которое он продуцирует, пытаемся понять, как оно работает.

SOS-сигнал бактерий

– Что такое SOS-сигнал, который вы изучаете?

– Это реакция бактерий на повреждение ДНК. То есть, если в бактерии появляется ДНК с двуцепочечным разрывом, то запускается механизм ответа. Он поможет обратно склеить ДНК, чтобы бактерия могла дальше жить. Пользуясь этим знанием, мы вставили флуоресцентный белок в плазмиду, в которой содержится промотор – sulA. А повреждённая ДНК связывается с белком LexA. Это приводит к тому, что sulA-промотор становится свободным. И дальше в клетке в норме после этого sulA-промотора стоят гены. Они кодируют белки, репарирующие ДНК, то есть помогающие сшить образовавшиеся повреждения. А в нашем случае, кроме того, синтезируется флюоресцентный белок. Он сигнализирует о повреждении ДНК. Нам важно разобраться, как именно повреждена ДНК, за счёт чего? И вот для этого у нас есть набор ферментов, которые взаимодействуют с ДНК, и мы исследуем влияние на них соединений.

– А перспективы какие?

– Мы можем найти соединение, которое будет повреждать ДНК, точнее – связываться с ферментами топоизомеразами. Если мы разберёмся, как именно оно с ними связывается, в каком месте и так далее, то, если это соединение не токсичное, то есть не вредит клеткам человека и вообще эукариотическим клеткам, то его можно попробовать использовать как лекарство. Но даже если соединение окажется по тем или иным причинам неприменимым как лекарство, мы будем знать, какой именно фрагмент отвечает за связывание с этими ферментами и в дальнейшем, возможно, модифицировать это соединение таким образом, чтобы оно всё-таки проявляло активность против бактериальных клеток и уже не было опасным для человеческих.

Природные vs синтетические соединения

– Каким соединениям отдаётся предпочтение – природным или синтезированным?

– На самом деле мы работаем и в ту, и в другую сторону, но природные соединения, зачастую всё-таки более специфичные, то есть они лучше связываются со своей мишенью и меньше шансов, что у них будет какая-то побочная активность.

– Но антибиотики ведь применяются не только для лечения инфекционных болезней, но и в онкологии?

– Стоит тогда оговориться, что именно понимается под антибиотиками. Классическое определение, предложенное микробиологами: антибиотик – это соединение природного происхождения, которое проявляет активность против бактерий. Если мы его хоть немножко изменим, то это уже не антибиотик, а антимикробный агент. В таком случае против рака антибиотики, конечно же, не работают. Но в последнее время всё чаще это определение расширяют и противораковый препарат относят к антибиотикам по той логике, что он тоже вредит живым клеткам.

– Но вы этим не занимаетесь, не так ли?

– Да, этим мы, скорее, не занимаемся, но у нас в лаборатории МГУ есть коллеги, которые ищут разные соединения, проявляющие противоопухолевую активность, и там свои антибиотики. Мы иногда им тоже даём на проверку наши соединения.

Недавние исследования

– Какие соединения вы недавно изучили?

– Только что вышла наша статья про антибиотик оксидиффицидин. Он был известен уже довольно давно, а мы показали, что оксидиффицидин селективно действует на биосинтез белка в бактериях и не действует на эукариотические клетки, и в целом он довольно нетоксичный. У него разница между минимальной ингибирующей концентрацией для бактерий и токсичной концентрацией для эукариотических клеток довольно велика. Это природное соединение продуцируется бациллой (штамм Bacillus felicensis). Мы провели с ним полную работу: нашли продуцентов, разобрались, как они синтезируют данное соединение, охарактеризовали его биохимически и т.д.

Влияние на микробиоту

– Сейчас много говорят про микробиоту, а антибиотики уничтожают полезные микроорганизмы, которые живут в нашем кишечнике. Как сделать антибиотик более селективным, чтобы он действовал только на патогенные бактерии?

– Пожалуй, лучший вариант – просто не принимать антибиотик лишний раз. Этим вопросом мы в прямом виде не занимаемся, но здесь ещё такая есть история: изначально тот же самый золотистый стафилококк – бактерия, сосуществующая с нами, кишечная палочка – тоже условный патоген. В норме она у нас живёт в кишечнике, у неё есть свои функции и полностью её убивать не нужно. Но в каких-то случаях, например, при ослаблении иммунитета, она может выйти из-под контроля и начать действовать негативно.

Достижения и цели

– Что вы считаете своим главным достижением?

– Надеюсь, что оно ещё впереди. На данный момент, это внедрение репортёрной системы и её активное использование в поиске соединений, проявляющих биологическую активность.

– Мечтаете получить Нобелевскую премию?

– Честно говоря, я думаю, что это маловероятно. Наша цель – найти и изучить какое-то новое соединение, и передать его тем, кто сможет его внедрить в практику. Например, мы изучили нибомицин. Он может действовать как на фторхинолонустойчивые, так и на фторхиналончувствительные штаммы. Если штамм становится устойчив к фторхинолонам, то довольно большой ряд антибиотиков сразу «вычёркивается». А мы показали, что нибомицин – природный ингибитор ДНК-топоизомераз II типа, он может быть использован тогда, когда классические ингибиторы гираз – фторхинолоны – не работают.

Ещё пример. Есть антибиотик тетраценомицин-Х. Раньше считали, что он действует подобно доксорубицину, который является интеркалирующим агентом и внедряется между азотистыми основаниями ДНК, препятствуя её удвоению. Мы выяснили, что его основная мишень – это рибосомы, где он подавляет биосинтез белка. Вместе с немецкими коллегами показали, где именно он связывается в рибосоме. С помощью метода, известного как тоупринтинг (toeprinting), можно отследить, на каком этапе трансляции рибосома останавливается. Но как антибиотик, который можно будет внедрить в клиническую практику, в нынешнем виде тетраценомицин-Х не подходит, потому что он может вредить эукариотической трансляции. Тетраценомицин-Х хорошо связывается как с бактериальной рибосомой, так и с человеческой. Таким образом, мы смогли разобраться как именно, где и с чем он связывается. Это, на мой взгляд, очень интересный результат.

Международное сотрудничество

– Каким образом осуществлялась коллаборация с Германией?

– Эта работа вышла в 2020-м, а фактически была сделана в 2017-2019 гг. Мы наработали соединение, и наш коллега поехал в Германию и там участвовал в разных биохимических экспериментах, позволивших получить его структуру.

Популяризация науки

– Вы – активный популяризатор науки, выступаете с лекциями и записываете видео. Зачем вам это? Широкая публика, наверное, с трудом понимает такие тонкие вещи?

– Я стараюсь максимально упрощать и подстраиваться под аудиторию. На мой взгляд, очень хорошо показать, что учёные занимаются интересными вещами, в том числе маленьким детям или школьникам: может быть, в дальнейшем они тоже увлекутся этой темой. Это первая часть истории.

Очень важно людям рассказывать, как именно работают антибиотики. Это не какая-то чудо-пилюля, которая может от всего излечить, и принимать их нужно после консультации с врачом. Возможно, людям будет интересно в это погрузиться и чуть больше разобраться. Я стараюсь не избегать такого общения.

– И для врачебной аудитории это, наверное, полезно.

– Врачи очень хорошо знают про клиническую практику, клинические испытания антибиотиков и т.д. А про какие-то предыдущие этапы им иногда тоже интересно узнать.
 

На иллюстрации -  репортёрная система для идентификации механизма действия антибиотиков

Figure 1: Рис. А – строение репортёрной плазмиды pDualrep2. Б – индукция двойной репортёрной системы, чувствительной к ингибиторам трансляции или веществам, повреждающим ДНК. Капли эритромицина (справа, 2 мкг), левофлоксацина (слева, 0.05 мкг) наносили на поверхность чашки с агаром, содержащей клетки E. coli JW5503, трансформированные плазмидой pDualrep2. Экспрессия Katushka2S (красный) запускается ингибиторами трансляции, а экспрессия TurboRFP (зеленый) индуцируется при повреждении ДНК